Die „Besonderheiten“ von Carboxyl- und Hydroxylgruppen in der Peptidsynthese

In der Peptidsynthese sind Carboxyl- und Hydroxylgruppen zwei häufig verwendete funktionelle Gruppen. Die Carboxylgruppe bildet die grundlegende Struktureinheit für den Aufbau von Peptidbindungen, während die Hydroxylgruppe aufgrund ihrer Nukleophilie häufig an Schutzgruppen- und Abspaltungsreaktionen von Seitenketten beteiligt ist. Beide spielen eine entscheidende Rolle in der Peptidsynthese. Aufgrund ihrer hohen Reaktivität neigen sie jedoch zu verschiedenen unerwarteten Nebenreaktionen während der Synthese, die die Reinheit und Ausbeute des Zielprodukts direkt beeinträchtigen . Im Folgenden fassen wir die häufigsten Nebenreaktionen dieser beiden Gruppen zusammen, um eine Orientierungshilfe für die praktische Anwendung zu bieten.

I. Carboxyl-Nebenreaktionen von Asparaginsäure (Asp)/Glutaminsäure (Glu)

Carboxyl-Nebenreaktionen treten hauptsächlich am Rückgrat und an den Seitenketten der Asparaginsäure (Asp)/Glutaminsäure (Glu) auf und lassen sich im Wesentlichen in folgende Kategorien einteilen:

1. Alkalikatalysierte Umesterung

Bei der Festphasensynthese werden Aminosäuren unter Verwendung von Chlormethylharz (Merrifield-Harz) mittels basenkatalysierter Substitutionsreaktionen als Esterbindungen an das Harz gebunden. Gängige Basen sind Cäsiumsalze, Triethylamin und Tetramethylammoniumhydroxid (TMAH), wobei TMAH eine überlegene katalytische Aktivität aufweist. Es tritt jedoch ein Problem auf: Dieser Prozess ist mit einer Umesterung des Benzylesters an der Asp/Glu-Seitenkette verbunden (siehe Abbildung 1). Im Methanol-System wird der Benzylester in einen Methylester umgewandelt, und im nachfolgenden HF-vermittelten Entschützungsschritt ist eine Entschirmung der Seitenkette schwierig.

Abbildung 1. Umesterungsnebenreaktion der Asp/Glu-Seitenkette

Diese Nebenreaktion kann jedoch, wenn sie genutzt wird, auch eine effektive Synthesestrategie darstellen. Beispielsweise kann durch die Behandlung von Peptid-Merrifield-Harz mit TMAH/tert-Butanol bei 70 °C der Benzylester der Asp/Glu-Seitenkette in den tert-Butylester umgewandelt werden, während gleichzeitig die Peptidkette vom Festphasenträger abgespalten wird, um direkt den entsprechenden C-terminalen tert-Butylester zu erhalten.

2. Methionisierungs-Nebenreaktion während der Pyrolyse und des Reinigungsprozesses

Bei der Abspaltung des Peptidharzes oder der globalen Entschützung von Seitenketten kann Restmethanol (z. B. aus dem Waschprozess) unter sauren Bedingungen die Carboxylgruppen des Peptids modifizieren und eine Methylesterifizierungs-Nebenreaktion auslösen. Daher sollte bei esterifizierungsempfindlichen Peptiden das Waschen des Harzes mit Methanol vermieden oder der Trocknungsprozess streng kontrolliert werden.

Auch, Bei der Reinigung mittels Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) wird Methanol aufgrund seiner Kostenvorteile häufig als organisches Eluent eingesetzt. Methanol/Wasser-Systeme erfordern jedoch typischerweise die Zugabe von sauren Modifikatoren wie Trifluoressigsäure (TFA) oder Ameisensäure, was zu einer sauren Peptidlösung führt. Bei der anschließenden Konzentrierung neigen die Carboxylgruppen der Asp/Glu-Seitenketten oder des Peptidrückgrats stark zur Methylesterifizierung, was die Peptidqualität beeinträchtigt. Bei starker Neigung zur Methylesterifizierung wird die Verwendung von Acetonitril als organisches Eluent empfohlen.

II. Hydroxyl-Nebenreaktionen von Serin (Ser)/Threonin ( Thr)

Serin (Ser) und Threonin ( Thr ) neigen aufgrund der Nukleophilie ihrer β-Hydroxylgruppen zu verschiedenen Nebenreaktionen in der Peptidsynthese . Gleichzeitig kann die Acylschutzgruppe an der Hydroxylgruppe unter bestimmten Bedingungen ebenfalls Nebenreaktionen wie O→N-Wanderung und β-Eliminierung eingehen.

1. Alkylierungsnebenreaktionen

Die einzigartige Orthogonalität der alloc-Schutzgruppe macht sie häufig für den selektiven Schutz von Hydroxylgruppen einsetzbar. Werden jedoch O- alloc- geschützte Serinreste unter Pd(0)-Katalyse entfernt, kann die alloc- geschützte Hydroxylgruppe eine O-Allylierungs-Nebenreaktion eingehen, wodurch ein O-allyl-geschütztes Serin-Nebenprodukt entsteht (Abbildung 2). Dieses Nebenprodukt ist gegenüber Pd(0) chemisch stabil, und die freie β-Hydroxylgruppe kann durch Verlängerung der Behandlungszeit nicht regeneriert werden . Diese Nebenreaktion lässt sich jedoch in Gegenwart eines wirksamen Acrylsäure-Fängers effektiv kontrollieren.

Abbildung 2. Durch Alloc -Deprotektion induzierte Allylierungsnebenreaktion

2. Acylierungs- und O→N- Migrations-Nebenreaktionen

Bei der Aminosäurekupplung kann die Verwendung überschüssiger Acylierungsreagenzien oder eine zu langsame Reaktion der Zielaminosäure die Nukleophiliedifferenz zwischen Hydroxyl- und Aminogruppe verringern, was zur Acylierung der β-Hydroxylgruppe in Ser/ Thre führt . Darüber hinaus unterliegt die acylierte Hydroxylgruppe während der Abspaltung der Aminoschutzgruppe und der anschließenden Alkalibehandlung einer Acyl- O→N- Wanderung, was einen unerwarteten Abbruch der Peptidkette zur Folge hat (Abbildung 3 ).

Abbildung 3 Acyl O→N- Migrationsreaktion

3. β-Eliminierungs-Nebenreaktionen

Die β-Eliminierung ist eine der häufigen Nebenreaktionen in Ser/ Thr. Wenn elektronenziehende Gruppen (wie Ts, Ms usw.) an die Hydroxylgruppen der Seitenketten von Ser/ Thr gebunden sind, treten β-Eliminierungsreaktionen unter basischen Bedingungen leicht auf (Abbildung 4).

β- Eliminierungsreaktion, katalysiert durch eine Base

Selbst bei ungeschützten Seitenketten verhindert Ser/Thre solche Reaktionen nicht vollständig. β-Eliminierungsreaktionen können weiterhin unter dem Einfluss von Faktoren wie Basenkonzentration, Temperatur, Reaktionszeit und Peptidsequenz auftreten. Darüber hinaus können einige Kupplungsreagenzien diese Nebenreaktion induzieren; beispielsweise können DSC-, CDI- und Carbodiimid-Kupplungsreagenzien die β-Hydroxylgruppen von Ser/Thre aktivieren und dadurch β- Eliminierungsreaktionen auslösen (Abbildung 5).

Abbildung 5. CDI-induzierte β- Eliminierungsreaktion

4. Bildung von Oxazol-Nebenprodukten

Die Bildung von Oxazol-Nebenprodukten erfolgt hauptsächlich auf zwei Wegen: Erstens kann die ungeschützte Serin-/ Threonin-Seitenkette , wenn das N-Terminus mit einem Carbamat (Z, Boc usw.) geschützt ist, unter alkalischen Bedingungen das Carbamatgerüst angreifen und ein Oxazolidinon-Nebenprodukt bilden (Abbildung 6). Daher kann das Auftreten von Nebenreaktionen wirksam vermieden werden , indem die β-Hydroxylgruppe des N-terminalen Serins/ Threons während der alkalischen Behandlung des Peptids geschützt oder mildere Reaktionsbedingungen angewendet werden .

Abbildung 6. Mechanismus der Oxazolidinonbildung

Zweitens können die Serin-/Threoninreste innerhalb der Peptidkette über β-Hydroxylgruppen benachbarte Peptidbindungen angreifen und so ein fünfgliedriges Zwischenprodukt bilden . Dieses Zwischenprodukt kann durch Acyl-N→O-Wanderung in ein Esterderivat oder durch Dehydratisierung und Oxidation in ein Oxazolin- oder sogar ein Oxazolprodukt umgewandelt werden (Abbildung 7) . Ähnliche Prozesse werden auch mit Cystein ( Cys ) und β-Aminoalanin beobachtet, wobei entsprechende Thiazolin-/Thiazolium- bzw. Imidazolin-/Imidazoliumderivate entstehen .

Abbildung 7. Mechanismus der Bildung isomerer Peptidester/Oxazolyl(line).

Spaltung durch umgekehrte Aldolkondensation

Die Ser/ Thre- Seitenkette bildet mit der benachbarten Carbonylgruppe eine β-Hydroxycarbonylstruktur – im Wesentlichen die Struktur eines Produkts nach der Aldolkondensation. Daher kann eine umgekehrte Aldolkondensationsspaltung sowohl unter sauren als auch unter alkalischen Bedingungen erfolgen. Unter alkalischen Bedingungen führt dieser Prozess zur Spaltung der Cα-Cβ-Bindung der Ser/ Thre -Reste, wodurch Formaldehyd/Acetaldehyd und die entsprechenden Ketonverbindungen entstehen ( Abbildung 8 ). Obwohl solche Nebenreaktionen selten sind, sollten sie bei der Peptidsynthese und ähnlichen Prozessen dennoch berücksichtigt werden.

Abbildung 8 Spaltung der umgekehrten Aldolkondensation

III . Zusammenfassung

Die obige Zusammenfassung beschreibt einige der häufigsten und typischsten Nebenreaktionen . In der Synthese sind Carboxyl- und Hydroxyl-Nebenreaktionen vielfältig in ihrer Form und komplex in ihrem Mechanismus. Die meisten lassen sich jedoch durch eine geeignete Auswahl von Schutzgruppen, die strikte Kontrolle der Prozessparameter und die Optimierung der Reaktionsbedingungen vermeiden. Ein umfassendes Verständnis der Muster dieser Nebenreaktionen ist eine wichtige Grundlage für die Verbesserung der Qualität und Ausbeute von Peptidwirkstoffen .

Unternehmensvorstellung

Suzhou Haofan Biotech Co., Ltd. (Börsenkürzel: 301393.SZ), gegründet 2003 und mit Hauptsitz in der Suzhou High-Tech-Zone, ist ein nationales Hightech-Unternehmen, das pharmazeutische Forschungs- und Entwicklungs- sowie Produktionsunternehmen weltweit mit Spezialrohstoffen beliefert. Die Produkte werden hauptsächlich in der Synthese von Peptiden, Nukleotiden und Arzneimitteln eingesetzt und umfassen ein breites Spektrum, darunter Kondensationsmittel für spezielle Amidbindungen, Schutzmittel, Vernetzungsmittel, Proteinvernetzungsmittel für Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, molekulare Bausteine, Liposomen und Phosphorreagenzien. Bis heute hat das Unternehmen über 1.500 verschiedene Produkte entwickelt und hergestellt.

Nach über zwei Jahrzehnten kontinuierlicher Anstrengungen und stetiger Weiterentwicklung hat Haofan Biotech seine Expertise im Bereich globaler Peptidsynthese-Reagenzien kontinuierlich ausgebaut. Das Unternehmen hat sich zu einem führenden Anbieter mit einem breiten Spektrum an kundenspezifischen Produkten und bedeutenden Vorteilen in der Großproduktion entwickelt und ist in der Lage, die spezifischen Bedürfnisse verschiedenster Kunden zu erfüllen. Wir laden alle Interessenten herzlich ein, sich mit uns in Verbindung zu setzen, um mehr über unser Produkt zu erfahren und Kooperationsmöglichkeiten auszuloten.

Referenzen:

[1] Nebenreaktionen in der Peptidsynthese. Yi Yang