Anwendung der biotinylierten Reagenzien NHS-LC-Biotin und Sulfo-NHS-LC-Biotin in einer neuen Methode zur intravaskulären Arzneimittelabgabe

1. Grundlegende Informationen zum Compound

2. Forschung zur Anwendung einer neuen intravaskulären Arzneimittelverabreichungsmethode

NHS-LC Biotin ist ein langkettiges, durch NHS-Ester aktiviertes Biotinylierungsreagenz zur Markierung primärer Amine (z. B. Protein-Lysin), dessen Membranpermeabilität es für die allgemeine intrazelluläre Markierung nützlich macht. Sulfo NHS-LC Biotin ist wasserlöslich und nicht spaltbar und kann als einfaches und wirksames Biotinylierungsreagenz für Antikörper, Proteine ​​und alle anderen primären aminhaltigen Makromoleküle in Lösung verwendet werden. Die spezifische Markierung von Zelloberflächenproteinen ist eine weitere häufige Anwendung dieser einzigartigen wasserlöslichen und membranundurchlässigen Reagenzien.

Katsumis Team veröffentlichte „Eine neuartige Methode zur intravaskulären Arzneimittelabgabe unter Verwendung der endothelialen Biotinylierung und des Avidin-Biotin-Systems". im Jahr 2001. In dieser Studie wurde ein neues intravaskuläres Medikamentenverabreichungssystem entwickelt, das aus dem Katheter injiziert wird. Um das Medikament im Gefäßsystem des Zielgewebes zu immobilisieren, wird das zelluläre Protein lebender Endothelzellen zunächst direkt durch ein Biotinylierungsreagenz biotinyliert und dann durch ein Affinitätsmedikament oder ein biotinyliertes Medikament unter Verwendung von Avidin als Linker gebunden.

In ersten Experimenten wurde die Biotinylierung kultivierter Rinderaortenendothelzellen (BAECs) in vitro untersucht, indem ein Biotinylierungsreagenz (NHS-LC-Biotin oder Sulfo-NHS-LC-Biotin) auf gewaschene intakte BAEC-Monoschichten aufgetragen wurde, und zeigte, dass die Menge an gebundenem Biotin anstieg Zellen hängt von der Konzentration des verwendeten Biotinreagenzes ab. Teilen Sie die Biotinkonzentration im Zelllysat durch die Proteinkonzentration im Lysat (ng Biotin/μg Protein), um den Wert zu normalisieren und einen möglichen Zellverlust während des Experiments zu berücksichtigen. Abbildung 1 zeigt die Beziehung zwischen der Dosis des Biotinylierungsreagenzes und der korrigierten Biotinkonzentration in Zelllysaten. Die Biotinkonzentration in Zelllysaten stieg mit steigenden Dosen von Biotinylierungsreagenzien. Beim Vergleich von NHS-LC-Biotin und Sulfo-NHS-LC-Biotin bei gleicher Konzentration wurden etwas mehr zelluläre Proteine ​​durch NHS-LC-Biotin biotinyliert. Beispielsweise hatten Zelllysate, die aus 1,8 mM NHS-LC-Biotin und Schwefel-NHS-LC-Biotin hergestellt wurden, Biotinkonzentrationen von 0,390 bzw. 0,304 ng pro 1 g Protein.

Zellgebundenes Biotin nimmt nach der Biotinylierung mit der Zeit ab und FITC-Avidin ist leicht verfügbar, wenn es auf biotinylierte BAEC-Monoschichten angewendet wird. Mit Zellen kombinieren. Der LDH-Freisetzungstest zeigte, dass das Sulfo-NHS-LC-Biotin für BAEC nur leicht zytotoxisch war, und der Koloniebildungstest zeigte nur leichte nachteilige Auswirkungen der Reagenzien. In-vivo-Studien wurden an den Nierenarterien normaler Kaninchen durchgeführt, indem NHS-LC-Biotinlösung durch einen Katheter in eine Niere injiziert wurde, um deren Gefäßsystem zu biotinylieren, und das Vehikel als Kontrolle in die andere Niere injiziert wurde, gefolgt von einer Perfusion mit Kochsalzlösung. Abschließend wurde eine FITC-Avidin-Lösung in beide Nieren injiziert, die nach Herausziehen des Katheters mit dem Blut ausgeschieden wurden. In histologischen Schnitten waren mehr als 85 % der Glomeruli in biotinylierten Nieren mit Fluorescein gefärbt, wohingegen keines der Glomeruli in den Kontrollen gefärbt war. In Nieren, die zwei Tage nach derselben Operation entnommen wurden, waren die meisten Glomeruli immer noch hell gefärbt. Abbildung 2 zeigt, dass nach der Biotinylierung die Biotinkonzentration in ECs mit der Zeit abnimmt. Bei der Verwendung von Schwefel-NHS-LC-Biotin nahm die Konzentration des biotinylierten Proteins im Laufe der Zeit schnell ab, wobei nach 24 Stunden nur noch eine geringe Menge übrig blieb. Andererseits wurde bei Verwendung von NHS-LC-Biotin eine große Anzahl von Biotinmolekülen (60 %) innerhalb von 24 Stunden nachgewiesen, und nach 48 Stunden waren immer noch etwa 40 % nachweisbar. Die aus den Daten berechneten Biotin-Halbwertszeiten betrugen 38,0 Stunden (NHS-LC-Biotin) bzw. 10,8 Stunden (Sulfo-NHS-LC-Biotin).

Alle BAEC wurden nach 24-stündiger Biotinylierung als Kontrolle mit 0,18–18 mM Sulfo-NHS-LC-Biotin und Lösungsmittelexposition mittels Phasenkontrastmikroskopie untersucht. Die Zellen aller Gruppen waren negativ und zeigten keine morphologischen Anomalien. Andererseits zeigte die Gruppe, die 18 mM Biotinylierungsreagenz ausgesetzt war, wie in Abbildung 3 gezeigt, einen leichten Anstieg der LDH-Spiegel im Vergleich zu niedrigen Dosen (0, 0,18 und 1,8 mM) Biotinylierung (Kruskal-Wo-Liss-Test, p< 0,02).

Um zu untersuchen, ob biotinylierte Inhibitoren die Lebensfähigkeit der Zellen verändern, wurde ihre Wirkung auf die Zellproliferation mithilfe eines Koloniebildungstests untersucht. Wie in Abbildung 4 dargestellt, nahm die Anzahl der BAEC-Kolonien mit zunehmender Reagenzienkonzentration ab. Die Hemmung der Koloniebildung war bei 1,8–5,4 mM offensichtlich (Kruskal-Wallis-Test, p < 0,01).

In diesem Experiment wurde auch untersucht, ob antibiotinylierte Arzneimittel auf lebensfähigen biotinylierten EC immobilisiert werden können. Die Ergebnisse sind in Abbildung 5 dargestellt. Die Konzentration des antiviralen FITC in Zelllysaten stieg mit der Erhöhung der Anfangsdosis des antiviralen FITC. Der Korrelationskoeffizient zwischen der Anfangsdosis von FITC-Avidin und seiner Konzentration in Zelllysaten betrug 0,987 (p = 0,012), wenn NHS-LC-Biotin verwendet wurde, und 0,977, wenn Sulfo-NHS-LC-Biotin verwendet wurde (p = 0,026).

Im letzten Experiment wurde biotinylierten Nieren eine Anti-Biotin-Lösung und anschließend eine Fluorescein-Biotin-Lösung injiziert. Kontrollnieren wurden zuvor nicht biotinyliert, erhielten jedoch die gleichen Anti-Biotin- und Fluorescein-Biotin-Injektionen wie oben, und mehr als 80 % der Glomeruli waren in biotinylierten Nieren gefärbt, in den Kontrollnieren jedoch nicht. Dies legt nahe, dass biotinylierte Arzneimittel über Anti-Biotin im biotinylierten Gefäßsystem verankert werden können, ohne vom Blut weggespült zu werden. Es wurden keine offensichtlichen Nebenwirkungen auf die Funktion biotinylierter Nieren festgestellt, und dieses Arzneimittelabgabesystem eignet sich zur Behandlung bestimmter vaskulärer pathologischer Zustände, wie z. B. der mikrovaskulären Proliferation bei bösartigen Tumoren und der kontinuierlichen Arzneimittelabgabe in bestimmte Zielorgane.

In dieser Studie wurde die Biotinylierung lebender Endothelzellen untersucht, um eine Methode zur Abgabe therapeutischer Arzneimittel an den Zielbereich und zur Verankerung des Arzneimittels an den vaskulären Endothelzellen in diesem Bereich zu entwickeln. Zwei Schlüsselelemente dieser Studie waren die Verwendung von Katheterisierung zur Arzneimittelabgabe und die Verwendung von Biotinderivaten von NHS-Estern zur Biotinylierung. Jüngste Fortschritte in der interventionellen Radiologie haben es ermöglicht, mithilfe der Gefäßkatheterisierung viele Stellen im Körper zu erreichen, und mithilfe der Katheterisierung haben wir Medikamente an Gefäßendothelzellen in der Kaninchenniere als Modellorgan abgegeben. Mehrere Forscher haben zuvor über die Biotinylierung tierischer Gewebezellen wie Erythrozyten, Lymphozyten und Endothelzellen unter Verwendung von Biotin-NHS-Ester-Derivaten für verschiedene Zwecke berichtet. NHS-Ester sind hochreaktiv mit Proteinen und Verbindungen mit NHS-Estern können durch zelluläre Proteine ​​auf lebenden Zellen immobilisiert werden. Fuente et al. berichteten über die Verwendung isolierter Lungen zur Biotinylierung des Lungenendothels, gefolgt von der Verabreichung des biotinylierten Reagens durch intravaskuläre Injektion. Die Studie von Katsumis Gruppe ist die erste, die die Biotinylierung von Gefäßendothelzellen für therapeutische Zwecke nutzt.