Anwendung der biotinylierten Reagenzien NHS-LC-Biotin und Sulfo-NHS-LC-Biotin in einer neuen Methode zur intravaskulären Arzneimittelabgabe

1. Grundlegende Informationen zur Verbindung

2. Forschung zur Anwendung einer neuen Methode zur intravaskulären Arzneimittelverabreichung

NHS-LC Biotin ist ein langkettiges, NHS-esteraktiviertes Biotinylierungsreagenz zur Markierung primärer Amine (wie Proteinlysin), dessen Membrandurchlässigkeit es für die allgemeine intrazelluläre Markierung nützlich macht. Sulfo NHS-LC Biotin ist wasserlöslich und nicht spaltbar und kann als einfaches und effektives Biotinylierungsreagenz für Antikörper, Proteine ​​und alle anderen primären Amin-haltigen Makromoleküle in Lösung verwendet werden. Die spezifische Markierung von Zelloberflächenproteinen ist eine weitere häufige Anwendung für diese einzigartigen wasserlöslichen und membranundurchlässigen Reagenzien.

Katsumis Team veröffentlichte 2001 „Eine neuartige Methode zur intravaskulären Verabreichung von Medikamenten unter Verwendung endothelialer Biotinylierung und des Avidin-Biotin-Systems". In dieser Studie wurde ein neues System zur intravaskulären Verabreichung von Medikamenten entwickelt, das aus einem Katheter injiziert wird. Um das Medikament im Gefäßsystem des Zielgewebes zu immobilisieren, wird das Zellprotein lebender Endothelzellen zunächst direkt mit einem Biotinylierungsreagenz biotinyliert und dann mit einem Affinitätsmedikament oder einem biotinylierten Medikament unter Verwendung von Avidin als Linker gebunden.

In ersten Experimenten wurde die Biotinylierung kultivierter boviner Aortenendothelzellen (BAECs) in vitro untersucht, indem ein Biotinylierungsreagenz (NHS-LC-Biotin oder Sulfo-NHS-LC-Biotin) auf gewaschene, intakte BAEC-Monoschichten aufgetragen wurde. Dabei zeigte sich, dass die Menge des an Zellen gebundenen Biotins von der Konzentration des aufgetragenen Biotinreagenz abhängt. Teilen Sie die Biotinkonzentration im Zelllysat durch die Proteinkonzentration im Lysat (ng Biotin/μg Protein), um den Wert zu normalisieren und mögliche Zellverluste während des Experiments zu berücksichtigen. Abbildung 1 zeigt die Beziehung zwischen der Dosis des Biotinylierungsreagenz und der korrigierten Biotinkonzentration in Zelllysaten. Die Biotinkonzentration in Zelllysaten nahm mit zunehmender Dosis der Biotinylierungsreagenzien zu. Beim Vergleich von NHS-LC-Biotin und Sulfo-NHS-LC-Biotin bei gleicher Konzentration wurden durch NHS-LC-Biotin etwas mehr zelluläre Proteine ​​biotinyliert. Beispielsweise wiesen Zelllysate, die aus 1,8 mM NHS-LC-Biotin und Sulfo-NHS-LC-Biotin hergestellt wurden, Biotinkonzentrationen von 0,390 bzw. 0,304 ng pro 1 g Protein auf.

Zellgebundenes Biotin nimmt nach der Biotinylierung mit der Zeit ab, und FITC-Avidin ist leicht verfügbar, wenn es auf biotinylierte BAEC-Monoschichten aufgetragen wird. Kombinieren Sie es mit Zellen. Der LDH-Freisetzungstest zeigte, dass das Sulfo-NHS-LC-Biotin für BAEC nur leicht zytotoxisch war, und der Koloniebildungstest zeigte nur leichte Nebenwirkungen der Reagenzien. In-vivo-Studien wurden an den Nierenarterien normaler Kaninchen durchgeführt, indem eine NHS-LC-Biotinlösung durch einen Katheter in eine Niere injiziert wurde, um deren Gefäßsystem zu biotinylieren, und das Vehikel als Kontrolle in die andere Niere injiziert wurde, gefolgt von einer Perfusion mit Kochsalzlösung. Schließlich wurde eine FITC-Avidin-Lösung in beide Nieren injiziert, die nach dem Herausziehen des Katheters mit dem Blut abgelehnt wurden. In histologischen Schnitten wurden mehr als 85 % der Glomeruli in biotinylierten Nieren mit Fluorescein gefärbt, während keine der Glomeruli in den Kontrollnieren gefärbt wurden. In Nieren, die 2 Tage nach derselben Operation entnommen wurden, waren die meisten Glomeruli immer noch hell gefärbt. Abbildung 2 zeigt, dass nach der Biotinylierung die Biotinkonzentration in ECs mit der Zeit abnimmt. Bei Verwendung von Sulfo-NHS-LC-Biotin nahm die Konzentration des biotinylierten Proteins mit der Zeit schnell ab, wobei nach 24 Stunden nur noch eine kleine Menge übrig war. Andererseits wurde bei Verwendung von NHS-LC-Biotin innerhalb von 24 Stunden eine große Anzahl von Biotinmolekülen (60 %) nachgewiesen, und nach 48 Stunden waren immer noch etwa 40 % nachweisbar. Die aus den Daten berechneten Biotinhalbwertszeiten betrugen 38,0 Stunden (NHS-LC-Biotin) bzw. 10,8 Stunden (Sulfo-NHS-LC-Biotin).

Alle BAEC wurden nach 24 Stunden Biotinylierung als Kontrollen mit 0,18-18 mM Sulfo-NHS-LC-Biotin und Lösungsmittelexposition mittels Phasenkontrastmikroskopie untersucht, und die Zellen aus allen Gruppen waren negativ und zeigten keine morphologischen Anomalien. Andererseits zeigte die Gruppe, die 18 mM Biotinylierungsreagenz ausgesetzt war, wie in Abbildung 3 dargestellt, einen leichten Anstieg der LDH-Werte im Vergleich zu niedrigen Dosen (0, 0,18 und 1,8 mM) der Biotinylierung (Kruskal-Wo-Liss-Test, p<0,02).

Um zu untersuchen, ob biotinylierte Inhibitoren die Zelllebensfähigkeit verändern, wurde ihre Wirkung auf die Zellproliferation mithilfe eines Koloniebildungstests untersucht. Wie in Abbildung 4 gezeigt, nahm die Anzahl der BAEC-Kolonien mit zunehmender Reagenzkonzentration ab. Eine Hemmung der Koloniebildung war bei 1,8–5,4 mM erkennbar (Kruskal-Wallis-Test, p<0,01).

In diesem Experiment wurde auch untersucht, ob antibiotinylierte Medikamente auf lebenden biotinylierten EC immobilisiert werden können. Die Ergebnisse sind in Abbildung 5 dargestellt. Die Konzentration des antiviralen FITC in Zelllysaten nahm mit der Erhöhung der Anfangsdosis des antiviralen FITC zu. Der Korrelationskoeffizient zwischen der Anfangsdosis von FITC-Avidin und seiner Konzentration in Zelllysaten betrug 0,987 (p = 0,012), wenn NHS-LC-Biotin verwendet wurde, und 0,977, wenn Sulfo-NHS-LC-Biotin verwendet wurde (p = 0,026).

Im letzten Experiment wurde biotinylierten Nieren eine Anti-Biotin-Lösung und anschließend eine Fluorescein-Biotin-Lösung injiziert. Kontrollnieren wurden nicht zuvor biotinyliert, erhielten aber die gleichen Anti-Biotin- und Fluorescein-Biotin-Injektionen wie oben, und mehr als 80 % der Glomeruli in biotinylierten Nieren wurden gefärbt, in Kontrollnieren jedoch nicht. Dies deutet darauf hin, dass biotinylierte Medikamente über Anti-Biotin an biotinylierten Gefäßen verankert werden können, ohne vom Blut weggespült zu werden. Es wurden keine offensichtlichen Nebenwirkungen in der Funktion biotinylierter Nieren festgestellt, und dieses Arzneimittelabgabesystem eignet sich zur Behandlung bestimmter vaskulärer pathologischer Zustände, wie z. B. mikrovaskulärer Proliferation bei bösartigen Tumoren, und zur kontinuierlichen Arzneimittelabgabe in bestimmten Zielorganen.

In dieser Studie wurde die Biotinylierung lebender Endothelzellen untersucht, um eine Methode zu entwickeln, mit der therapeutische Medikamente in das Zielgebiet gebracht und an den vaskulären Endothelzellen in diesem Gebiet verankert werden können. Zwei Schlüsselelemente dieser Studie waren der Einsatz von Kathetern zur Medikamentenverabreichung und die Verwendung von Biotinderivaten von NHS-Estern zur Biotinylierung. Jüngste Fortschritte in der interventionellen Radiologie haben es möglich gemacht, mittels Gefäßkatheterisierung viele Stellen im Körper zu erreichen, und mittels Katheterisierung konnten wir Medikamente an vaskuläre Endothelzellen in der Kaninchenniere als Modellorgan abgeben. Mehrere Forscher haben zuvor über die Biotinylierung von tierischen Gewebezellen wie Erythrozyten, Lymphozyten und Endothelzellen unter Verwendung von Biotin-NHS-Esterderivaten für verschiedene Zwecke berichtet. NHS-Ester reagieren stark mit Proteinen, und Verbindungen mit NHS-Estern können durch zelluläre Proteine ​​auf lebenden Zellen immobilisiert werden. Fuente et al. berichteten über die Verwendung isolierter Lungen zur Biotinylierung des Lungenendothels, gefolgt von der Verabreichung des biotinylierten Reagenzes durch intravaskuläre Injektion. Die Studie von Katsumis Gruppe ist die erste, bei der die Biotinylierung von vaskulären Endothelzellen zu therapeutischen Zwecken eingesetzt wird.