Ein Fmoc-Schutzreagenz: Fmoc-Amox

Die meisten Peptidsynthesen werden durch Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung von Fmoc- oder Boc-Schutzmethoden erreicht. Bei Verwendung von Fmoc-OSu scheint sich jedoch die Einführung von ungeschütztem N in Fmoc aufgrund der Bildung von Dipeptid- (oder Tripeptid-) und β-Alaninamid-Verunreinigungen in der Aminosäure als schwierig zu erweisen. Hier stellen wir eine effiziente Methode zur Synthese von Fmoc-Gly-OH auf Basis des Oximderivats Fmoc-Amox ohne Nebenreaktionen vor. Fmoc-Amox ist kostengünstig und Amox kann nach der Reaktion leicht entfernt werden, wodurch reines Fmoc-Gly-OH ohne schädliche Verunreinigungen oder Schadstoffe (hauptsächlich Dipeptide oder Amox selbst) entsteht, das durch hocheffiziente Flüssigphasenchromatographie und NMR gewonnen werden kann.

1963 beschrieb Merrifield ein neues Konzept der chemischen Synthese. Die Wirkstoffe (API) einiger auf dem Markt erhältlicher Medikamente sind TIDES (Oligonukleotid- und Peptidtherapeutika), die bis zu 30–40 Monomere enthalten. Die Körper wurden mithilfe einer Festphasenmethode hergestellt, die erstmals von Merrifield beschrieben wurde. Obwohl die Methode der Festphasenpeptidsynthese (SPPS) von seinen europäischen Kollegen zunächst in gewissem Maße in Frage gestellt wurde, wird sie heute in der synthetischen Forschung und Produktion weithin eingesetzt.

Wie aus der Nomenklatur ersichtlich, besitzen alle Aminosäuren mindestens zwei funktionelle Gruppen: eine Carbonsäure- und eine Aminogruppe. Wenn die Aktivität der C-terminalen Carbonsäure der Aminosäure durch eine unlösliche Polymergruppe abgedeckt ist, wird die Aminogruppe vorübergehend geschützt und nimmt dann schrittweise und kontinuierlich an der Reaktion teil, einschließlich der Entfernung der Schutzgruppe der Aminogruppe und der anschließenden Kopplung mit der nächsten N-geschützten Aminosäure. Bei trifunktionellen Aminosäuren sind die Seitenketten jedoch durch permanente (oder semipermanente) Schutzgruppen geschützt. In den Anfangsjahren verwendete Merrifield Benzyl (Bn) für den Langzeitschutz und tert-Butoxycarbonyl (Boc) als temporäre Schutzgruppe, aber sowohl Boc als auch Bn können unter sauren Bedingungen zersetzt werden: Trifluoressigsäure (TFA) de-Boc, starke Säuren wie HF oder Trifluormethansulfonsäure (TFMSA) hydrolysieren Bn. In den 1970er Jahren revolutionierte Carpino, der auch die Boc-Schutzgruppe vorschlug, das Gebiet der Peptidchemie, indem er Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) als Gruppe zum vorübergehenden Schutz der Aminogruppe vorschlug, d. h. die N-Schutzgruppe kann mit einer Base entfernt werden, was sie orthogonal zur Boc-Gruppe macht. Darüber hinaus entwickelten Sheppard und Atherton in Europa zusammen mit Chang und Meienhofer in den USA zur gleichen Zeit die Fmoc/t-Bu-Methode, und die Reaktion wurde mit TFA-Lösung behandelt, um das Peptid freizusetzen. Die Umsetzung dieser Methode markiert die „Zivilisierung" der Peptidsynthese, da die Verwendung der Boc/Bn-Methode ausgebildete Chemiker und spezielle Geräte erfordert, während mit der Fmoc/t-Bu-Methode auch andere biologische Laboratorien Peptide synthetisieren können. Darüber hinaus hat diese Methode die Produktion von Peptiden im Kilogramm-Maßstab ermöglicht.

Die ersten kommerziellen Fmoc-Aminosäuren wurden mit der Schotten-Baumann-Methode synthetisiert: Die Aminosäure wurde unter basischen Bedingungen mit Fmoc-Cl umgesetzt (Abb. 1A). Anfang der 1980er Jahre wiesen die Ashish-Gruppe sowie Bachem und Goodman darauf hin, dass die meisten kommerziellen Fmoc-Aminosäuren Dipeptide und Tripeptide enthalten. Diese Verunreinigungen sind auf die hohe Reaktivität von Fmoc-Cl zurückzuführen, das auch mit der Carboxylgruppe der zu schützenden Aminosäure reagieren kann. Anhydrid, das wiederum mit dem Amin-Terminus eines anderen Aminosäuremoleküls reagieren kann, was zur Bildung eines Dipeptids führt. Der Mechanismus ist in Abbildung 1B dargestellt.

Abbildung 1 Fmoc-Schutz von Aminosäuren
A. Fmoc-Schutzmechanismus
B. Mechanismus der Bildung geschützter Dipeptide während des Aminosäureschutzes

In Anbetracht der Tatsache, dass selbst kleine Verunreinigungen zu Ausbeute- und Reinheitsverlusten führen können, kamen die Beteiligten gemeinsam zu dem Schluss, dass Fmoc-Cl vermieden werden sollte. Da diese Nebenreaktionen mit der Masse der Abgangsgruppe zusammenhängen, schlug Ashishs Gruppe die Verwendung von Fmoc-N3 vor, das auch von Carpino und Han in ihrem Artikel erwähnt wurde. Die Ashish-Gruppe schlug vor, Fmoc-N3 mit Fmoc-Cl und Natriumazid zu synthetisieren. Um die bei der Herstellung und Lagerung von Fmoc-N3 auftretenden Gefahren zu vermeiden, wird dieses nun verwendet. Die mit dieser Methode synthetisierte Fmoc-Aminosäure weist eine höhere Reinheit auf. Verlander et al. schlugen die Verwendung von Fmoc-OSU durch Screening verschiedener Abgangsgruppen vor, während Bolin et al. die Verwendung von Silylierungsreagenzien zum Schutz der Carboxylgruppe vorschlugen. Viele Jahre später schlugen Barlos et al. eine Methode zur Herstellung von Trt-Aminosäuren aus Trt-Cl vor, um die Bildung von Trt-Esterverunreinigungen zu vermeiden. Später schlugen Suresh et al. schlug die Herstellung von Fmoc-Aminosäuren aus Fmoc-Cl in Gegenwart von aktiviertem Zinkpulver vor, was neutrale Bedingungen ermöglichte.

Lange Zeit war jedoch Fmoc-OSu (oder NHS) die am häufigsten verwendete Methode zur Synthese von Fmoc-Aminosäuren, was ebenfalls in Frage gestellt wurde, als Hlebowicz et al. Die Forschung von Bachem Europe zeigt, dass unter Verwendung von Fmoc-OSu hergestelltes Fmoc-AA-OH Fmoc-β-Ala-OH und Fmoc-β-Ala-AA-OH enthält und diese beiden Verunreinigungen durch Lossen gelangen, nachdem OSu eine Carbonylgruppe angreift. gebildet durch Umlagerung (Abbildung 2).

Abbildung 2 Der Bildungsmechanismus von β-Alaninamid durch Lossen-Umlagerung

Diese Erkenntnisse haben die Forschungsbegeisterung für die Entwicklung neuer Reagenzien oder Methoden zur sicheren Einführung von Fmoc-Gruppen neu belebt. Tabelle 1 listet die verschiedenen zum Schutz von Aminosäuren verwendeten Fmoc-Derivate und ihre Ergebnisse bei der Herstellung von Fmoc-Gly-OH auf. Obwohl diese Reaktion zum Schutz aller Aminosäuren verwendet werden kann, ist Gly aufgrund seiner geringen sterischen Hinderung offensichtlicher. Fördert eine hocheffiziente Polymerisation. Diese mit Fmoc eingeführten Derivate sollten zwei Hauptmerkmale aufweisen: (i) keine besonders hohe Reaktivität, wodurch die Bildung von Oligopeptiden vermieden wird; (ii) die Abgangsgruppe ist normalerweise eine durch eine Aminosäure ersetzte Hydroxylverbindung, die während der Verarbeitung relativ stabil ist. Leichter zu entfernen. Daher schlug die Ashish-Gruppe erstmals Fmoc-2-Mercaptobenzimidazol vor, das Fmoc-Derivate mit weniger Oligopeptiden synthetisierte (Tabelle 1, Nr. 4). Das bei der Reaktion freigesetzte Nebenprodukt 2-MBT ist jedoch schlecht löslich und muss durch Waschen mit organischen Lösungsmitteln vollständig entfernt werden, während Fmoc-Aminosäuren ebenfalls eine gewisse Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln aufweisen, was der Endausbeute nicht zuträglich ist. Ein ähnliches Problem trat bei Verlander et al. auf, als bei der Verwendung von (Poly)chlorphenylderivaten organische Lösungsmittelalkohole das Endprodukt verunreinigten, was zu niedrigen Gesamtausbeuten (4-30 %) führte.

Derivate anderer Succinimide wie Phthalimid, Norbornenyl (ein freies Radikal, das von Norbornen abgeleitet ist) und die entsprechenden Spiro-Analoga, sechsgliedrigen Derivate usw. wurden ebenfalls analysiert, wiesen jedoch keinen signifikanten Vorteil auf (Tabelle 1, Nr. 5–7). Gleichzeitig wurde die Bildung von β-Alanin festgestellt, wenn Norbornengruppen mit EDC für die Festphasenpeptidsynthese (SPPS) in Wasser kombiniert wurden. Um das Problem der Interkalation von β-Alaninamid-Resten zu lösen, das durch die Verwendung von Succinimid-Derivaten verursacht wird, schlugen Najera et al. ein Reagenz in Form eines Polymers vor und die endgültige β-Alaninamid-Verunreinigung wurde auf dem Polymerträger immobilisiert. Allerdings ist diese Methode nur zur Herstellung kleiner Mengen geschützter Aminosäuren geeignet.

Andere reaktive Substanzen, die häufig mit Carbodiimid-Kopplungsverbindungen verwendet werden, wie Pentafluorphenyl (Pfp) oder Benzotriazol (Bt), sind zwar relativ teuer (Pfp) oder explosiv (Bt) (Tabelle 1, Nr. 8, 9), liefern aber hohe Erträge, und einige Laboratorien haben sogar Fmoc-Triazinderivate (Tabelle 1, Nr. 10) als Methode zur Synthese von Fmoc-Aminosäuren untersucht. Für die Methode zur Einführung von Fmoc unter Verwendung einer reinen wässrigen Lösung wurde Fmoc-Phenyldimethylsulfoniummethylsulfat (Fmoc-ODsp) verwendet, die Bildung von Dipeptiden wurde jedoch nicht untersucht (Tabelle 1, Nr. 11).

Um eine der größten Herausforderungen bei der Synthese von Peptidbausteinen zu überwinden, nämlich die unerwünschte Bildung von Dipeptiden und Tripeptiden während des Aminosäureschutzes, wurde der Ansatz einer großen Anzahl von Fmoc-Abgangsgruppen intensiv untersucht. Obwohl eine kleine Anzahl von Reagenzien anständige Ergebnisse lieferte, hat fast keines von ihnen das Potenzial, in der industriellen Produktion verwendet zu werden. In dieser Hinsicht wurde basierend auf der Struktur des häufig verwendeten Carbodiimid-Additivs Oxim das Fmoc-Abgangsgruppenderivat Fmoc-Amox vorgeschlagen. Fmoc-Amox wurde verwendet, um H-Gly-OH zu schützen, das sehr anfällig für Nebenreaktionen ist, mit einer hohen Ausbeute (93 %), und es gibt überhaupt kein Nebenprodukt in Form von Fmoc-Dipeptid, was durch HPLC- und NMR-Analyse bestätigt werden kann. Darüber hinaus können Amox-Derivate in Zukunft verwendet werden, um andere Schutzgruppen wie pNZ, Alloc und Boc einzuführen.

Die Ashish-Gruppe ist davon überzeugt, dass Oxyma ein besserer Zusatzstoff als Carbodiimid ist. Oxyma ist stark reaktiv und wird zunehmend bei der industriellen Herstellung von Peptiden verwendet. Die Gruppe untersuchte auch andere, weniger reaktive Oximderivate, um die Fmoc-Gruppe einzuführen. Aus dem ersten Screening (Tabelle 1, Nr. 12–16) ergab sich beispielsweise 2-Hydroxypyridin-N-oxid (HOPO), das aus Oxyma gewonnen wird (Tabelle 1, Nr. 12), aufgrund seiner hohen Reaktivität einen höheren Dipeptidgehalt, gefolgt von HOPO (Tabelle 1, Nr. 16). Cyanopyridiniumoxim ist ebenfalls ein guter Zusatzstoff (Tabelle 1, Nr. 15), aber es ist teuer und lässt sich nur schwer aus der Reaktion entfernen. Die Dipeptidbildung war im zweiten Screening allgemein geringer (Tabelle 1, Nr. 17–20), sodass das Cyanoamid-Derivat (Amox) (Tabelle 1, Nr. 20) als Alternative zu HOSu gewählt wurde, um Fmoc einzuführen. Fmoc-Amox ist erschwinglich und kann nach der Reaktion leicht entfernt werden. Anders als MBT hat Amox eine Löslichkeit von 0,9 M in Wasser, wodurch sichergestellt wird, dass es die endgültige Fmoc-Aminosäure nicht verunreinigt (Tabelle 1, Nr. 4).

In Bezug auf die Bildung von Fmoc-Dipeptiden erwies sich H-Gly-OH als das beste Reagenz zur Bewertung der Leistung von Fmoc-Amox, da seine geringe sterische Hinderung eine hohe Oligomerisierungsrate begünstigt. Bei Verwendung von 1 Gramm und 40 Gramm aus zwei parallelen Experimenten zur Herstellung von Fmoc-Gly-OH lagen die Ergebnisse nahe beieinander, und der Reaktionsprozess wird wie folgt beschrieben: Die Acetonlösung von Fmoc-Amox wird langsam zur gerührten wässrigen H-Gly-OH- und Natriumcarbonatlösung gegeben, durch kontinuierliche Trennung wurde Natriumcarbonat chargenweise zugegeben, um den pH-Wert des Reaktionsgemischs bei 9-10 zu halten. Die Reaktion wurde per DC sowie auf pH-Stabilität überwacht (ein Abfall des pH-Werts als Anzeichen einer Reaktion). Nach Abschluss der Reaktion (4 Stunden) wurde das Lösungsmittel entfernt und die verbleibende Wasserschicht mit DCM gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 1N HCl (bis pH < 2), was zu einem cremefarbenen Niederschlag führte, der dann gefiltert und mit Ethylacetat und n-Hexan (93 %) behandelt wurde. Nach der Umkristallisation war die durch HPLC festgestellte Reinheit von Fmoc-Gly-OH sehr gut. Da durch Festphasentechnologie hergestelltes Fmoc-Gly-Gly-OH zusammen mit Fmoc-Gly-OH eluiert wird, deutet dies darauf hin, dass die gebildete Dipeptidverunreinigung schwer zu entfernen ist, wie in Abbildung 3 gezeigt, im Chromatogramm sind keine Spuren von Dipeptiden zu beobachten (Abbildung 3). Darüber hinaus zeigte 1H-NMR keine Verunreinigung von Amox (Abb. 4), was deutlich zeigt, dass Amox bei der Synthese von Fmoc-Aminosäuren einen großen Vorteil bietet.

Abbildung 3 (A) HPLC-Chromatogramme von Fmoc-Gly-OH und Fmoc-Gly-Gly-OH, die gemeinsam eluieren
(B) HPLC-Chromatogramm von Fmoc-Gly-OH

Abbildung 4 Vergleich von 1H und 13C NMR von Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Amox und Amox

Motiviert durch diese Ergebnisse wurden Fmoc-Phe-OH und Fmoc-Val-OH (jeweils 10 g Miniversuche) mit der oben beschriebenen Methode hergestellt (Abbildungen 5 und 6). Die Reinheit des Endprodukts wurde durch HPLC und NMR bestätigt und zeigte keine Spurenbildung von Dipeptid. Die Bedeutung des Lösungsmittels während der Aufarbeitung wurde ebenfalls untersucht. Das resultierende Produkt wurde in DCM gelöst und mit destilliertem Wasser extrahiert. Die DCM-Aufarbeitung half, Spuren von Amox zu entfernen, was zu einem reinen Produkt führte, wie durch NMR bestätigt wurde (Abbildung 7).

Abbildung 5 (I) A. HPLC-Chromatogramm von Fmoc-Phe-OH und Fmoc-Phe-Phe-OH, die gemeinsam eluieren
B. HPLC-Chromatogramm von Fmoc-Phe-OH
(II) 1H- und 13C-NMR-Vergleich von Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Amox und Amox

Abbildung 6 (I) A. HPLC-Chromatogramm von Fmoc-Val-OH und Fmoc-Val-Val-OH, die gemeinsam eluieren
B. HPLC-Chromatogramm von Fmoc-Val-OH
(II) 1H- und 13C-NMR-Vergleich von Fmoc-Val-OH, Fmoc-Amox und Amox

Abbildung 7 Vergleich der Nachbehandlungen von mit Ethylacetat und DCM extrahiertem Fmoc-Phe-OH

Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass Fmoc-Amox große Vorteile bei der Synthese von Fmoc-Aminosäuren hat, die am anfälligsten für Nebenreaktionen sind.

Beispiel für die Synthese von Fmoc-Aminosäuren:

1. Glycin (131,34 mmol) und Natriumcarbonat (106 mmol) zu gereinigtem Wasser hinzufügen und tropfenweise eine Fmoc-Amox-Acetonlösung (119,4 mmol) hinzufügen, um sicherzustellen, dass der pH-Wert der Reaktionslösung immer bei 9–10 gehalten wird. Nachdem DC festgestellt hatte, dass die Fmoc-Amox-Reaktion abgeschlossen war, wurde die Reaktionslösung konzentriert, um Aceton zu entfernen, und dann mit Dichlormethan extrahiert, um Verunreinigungen zu entfernen. Die wässrige Phase wurde mit 1 N HCl angesäuert und eine große Menge weißer Feststoff fiel aus. Nach der Filtration wurde der Filterkuchen dreimal mit gereinigtem Wasser gewaschen. Der gesammelte Feststoff wurde mit Ethylacetat/n-Hexan umkristallisiert, um hochreines Fmoc-Glycin zu erhalten.

2. Phenylalanin oder Valin (33 mmol) und Natriumcarbonat (75 mmol) zu gereinigtem Wasser hinzufügen und tropfenweise eine Fmoc-Amox-Acetonlösung (30 mmol) hinzufügen, um sicherzustellen, dass der pH-Wert der Reaktionslösung immer bei 9–10 gehalten wird. Nachdem DC festgestellt hatte, dass die Fmoc-Amox-Reaktion abgeschlossen war, wurde die Reaktionslösung konzentriert, um Aceton zu entfernen, und dann mit Dichlormethan extrahiert, um Verunreinigungen zu entfernen. Die wässrige Phase wurde mit 1 N HCl angesäuert und eine große Menge weißer Feststoff fiel aus. Nach der Filtration wurde der Filterkuchen dreimal mit gereinigtem Wasser gewaschen. Der gesammelte Feststoff wurde mit Ethylacetat/n-Hexan umkristallisiert, um hochreines Fmoc-Phenylalanin oder Fmoc-Valin zu erhalten.

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