Ein Fmoc-Schutzreagenz: Fmoc-Amox

Die meisten Peptidsynthesen werden durch Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung von Fmoc- oder Boc-Schutzmethoden erreicht. Bei der Verwendung von Fmoc-OSu kommt es jedoch aufgrund der Bildung von Dipeptid- (oder Tripeptid-) und β-Alaninamid-Verunreinigungen in der Aminosäure zu einer ungeschützten Einführung N in Fmoc scheint eine Herausforderung zu sein. Hier stellen wir eine effiziente Methode zur Synthese von Fmoc-Gly-OH auf Basis des Oximderivats Fmoc-Amox ohne Nebenreaktionen vor. Fmoc-Amox ist kostengünstig und Amox kann nach der Reaktion leicht entfernt werden, wodurch reines Fmoc-Gly-OH ohne schädliche Verunreinigungen oder Verunreinigungen (hauptsächlich Dipeptide oder Amox selbst) bereitgestellt wird, das durch hocheffiziente Flüssigphasenchromatographie gewonnen werden kann NMR wurden nachgewiesen.

1963 beschrieb Merrifield ein neues Konzept der chemischen Synthese. Die Wirkstoffe (API) einiger Medikamente auf dem Markt sind TIDES (Oligonukleotid- und Peptidtherapeutika), die bis zu 30–40 Monomere enthalten. Die Körper wurden mit einem Festphasenverfahren hergestellt, das erstmals von Merrifield beschrieben wurde. Obwohl die Methode der Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) von seinen europäischen Kollegen zunächst teilweise in Frage gestellt wurde, wird sie heute in der Syntheseforschung und -produktion häufig eingesetzt.

Wie aus der Nomenklatur hervorgeht, verfügen alle Aminosäuren über mindestens zwei funktionelle Gruppen: eine Carbonsäure- und eine Aminogruppe. Wenn die Aktivität der C-terminalen Carbonsäure der Aminosäure durch eine unlösliche Polymergruppe abgedeckt ist, wird die Aminogruppe vorübergehend geschützt und nimmt dann Schritt für Schritt und kontinuierlich an der Reaktion teil, einschließlich der Entfernung der Schutzgruppe der Aminogruppe und dann Kopplung mit dem nächsten N-geschützten Aminosäurepaar. Bei trifunktionellen Aminosäuren sind die Seitenketten jedoch durch permanente (oder semipermanente) Schutzgruppen geschützt. In den Anfangsjahren verwendete Merrifield Benzyl (Bn) für den Langzeitschutz und Start-Butoxycarbonyl (Boc) als temporäre Schutzgruppe, aber sowohl Boc als auch Bn können unter sauren Bedingungen zersetzt werden: Trifluoressigsäure (TFA) de-Boc , Starke Säuren wie HF oder Trifluormethansulfonsäure (TFMSA) hydrolysieren Bn. In den 1970er Jahren revolutionierte Carpino, der auch die Boc-Schutzgruppe vorschlug, das Gebiet der Peptidchemie, indem er Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) als Gruppe zum vorübergehenden Schutz der Aminogruppe vorschlug, d. h. die N-Schutzgruppe kann mit einer Base entfernt werden. Sie ist somit orthogonal zur Boc-Gruppe. Darüber hinaus entwickelten Sheppard und Atherton in Europa zusammen mit Chang und Meienhofer in den Vereinigten Staaten gleichzeitig die Fmoc/t-Bu-Methode und die Reaktion wurde mit TFA-Lösung behandelt, um das Peptid freizusetzen. Die Umsetzung dieser Methode markiert die „Zivilisierung" der Menschheit. der Peptidsynthese, da die Verwendung der Boc/Bn-Methode geschulte Chemiker und spezielle Ausrüstung erfordert, während andere biologische Laboratorien mit der Fmoc/t-Bu-Methode auch Peptide synthetisieren können. Darüber hinaus ermöglichte diese Methode die Produktion von Peptiden im Kilogrammmaßstab.

Die ersten kommerziellen Fmoc-Aminosäuren wurden nach der Schotten-Baumann-Methode synthetisiert: Die Aminosäure wurde mit Fmoc-Cl unter basischen Bedingungen umgesetzt (Abb. 1A). In den frühen 1980er Jahren wiesen die Ashish-Gruppe sowie Bachem und Goodman darauf hin, dass die meisten kommerziellen Fmoc-Aminosäuren Dipeptide und Tripeptide enthalten. Diese Verunreinigungen entstehen durch die hohe Reaktivität von Fmoc-Cl, das auch mit der Carboxylgruppe der zu schützenden Aminosäure reagieren kann. Anhydrid, das wiederum mit dem Aminterminus eines anderen Aminosäuremoleküls reagieren kann, was zur Bildung eines Dipeptids führt. Der Mechanismus ist in Abbildung 1B dargestellt.

Abbildung 1 Fmoc-Schutz von Aminosäuren
A. FMOC-Schutzmechanismus
B. Mechanismus der Bildung geschützter Dipeptide während des Aminosäureschutzes

In Anbetracht der Tatsache, dass bereits ein geringer Anteil an Verunreinigungen zu Ausbeute- und Reinheitseinbußen führen kann, kamen die Parteien gemeinsam zu dem Schluss, dass Fmoc-Cl vermieden werden sollte. Da diese Nebenreaktionen mit der Masse der Abgangsgruppe zusammenhängen, schlug Ashishs Gruppe die Verwendung von Fmoc-N3 vor, das auch von Carpino und Han in ihrer Arbeit erwähnt wurde. Die Ashish-Gruppe schlug vor, Fmoc-N3 mit Fmoc-Cl und Natriumazid zu synthetisieren. Um die Gefahr der Herstellung und Lagerung von Fmoc-N3 zu vermeiden, wird es jetzt verwendet. Die mit dieser Methode synthetisierte Fmoc-Aminosäure weist eine höhere Reinheit auf. Verlander et al. schlugen die Verwendung von Fmoc-OSU durch Screening verschiedener Abgangsgruppen vor, während Bolin et al. schlugen die Verwendung von Silylierungsreagenzien zum Schutz der Carboxylgruppe vor. Viele Jahre später schlugen Barlos et al. eine Methode zur Herstellung von Trt-Aminosäuren aus Trt-Cl vor, um die Bildung von Trt-Ester-Verunreinigungen zu vermeiden. Später stellten Suresh et al. schlugen die Herstellung von Fmoc-Aminosäuren aus Fmoc-Cl in Gegenwart von aktiviertem Zinkpulver vor, was neutrale Bedingungen ermöglichte.

Die am häufigsten verwendete Methode zur Synthese von Fmoc-Aminosäuren war jedoch lange Zeit Fmoc-OSu (oder NHS), was auch in Frage gestellt wurde, als Hlebowicz et al. Die Forschung von Bachem Europe zeigt, dass mit Fmoc-OSu hergestelltes Fmoc-AA-OH Fmoc-β-Ala-OH und Fmoc-β-Ala-AA-OH enthält und diese beiden Verunreinigungen durch Lossen passieren, nachdem OSu ein Carbonyl angreift Gruppe. durch Umlagerung gebildet (Abbildung 2).

Abbildung 2 Der Bildungsmechanismus von β-Alaninamid durch Lossen-Umlagerung

Diese Erkenntnisse haben die Forschungsbegeisterung für die Entwicklung neuer Reagenzien oder Methoden zur sicheren Einführung von Fmoc-Gruppen neu belebt. Tabelle 1 listet die verschiedenen Fmoc-Derivate auf, die zum Schutz von Aminosäuren verwendet werden, und ihre Ergebnisse für die Herstellung von Fmoc-Gly-OH. Obwohl diese Reaktion zum Schutz aller Aminosäuren eingesetzt werden kann, ist Gly aufgrund seiner geringen sterischen Hinderung offensichtlicher. Fördert eine hocheffiziente Polymerisation. Diese mit Fmoc eingeführten Derivate sollten zwei Hauptmerkmale aufweisen: (i) keine besonders hohe Reaktivität, wodurch die Bildung von Oligopeptiden vermieden wird; (ii) die Abgangsgruppe ist normalerweise eine durch eine Aminosäure substituierte Hydroxylverbindung, die während der Verarbeitung relativ stabil ist. Leichter zu entfernen. Daher schlug die Ashish-Gruppe zunächst Fmoc-2-Mercaptobenzimidazol vor, das Fmoc-Derivate mit weniger Oligopeptiden synthetisierte (Tabelle 1, Nr. 4). Allerdings ist das bei der Reaktion freigesetzte Nebenprodukt 2-MBT schlecht löslich und muss durch Waschen mit organischen Lösungsmitteln vollständig entfernt werden, während Fmoc-Aminosäuren auch eine gewisse Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln aufweisen, was der Endausbeute nicht förderlich ist. Auf ein ähnliches Problem stießen Verlander et al.: Bei der Verwendung von (Poly)chlorphenylderivaten verunreinigen organische Lösungsmittelalkohole das Endprodukt, was zu niedrigen Gesamtausbeuten (4–30 %) führt.

Derivate anderer Succinimide wie Phthalimid, Norbornenyl (ein von Norbornen abgeleitetes freies Radikal) und die entsprechenden Spiro-Analoga, sechsgliedrigen Derivate usw. wurden ebenfalls analysiert, hatten jedoch keinen signifikanten Vorteil (Tabelle 1). , #5-7). Gleichzeitig wurde die Bildung von β-Alanin nachgewiesen, wenn Norbornengruppen mit EDC für die Festphasenpeptidsynthese (SPPS) in Wasser kombiniert wurden. Um das Problem der Interkalation von β-Alaninamid-Resten zu überwinden, das durch die Verwendung von Succinimid-Derivaten verursacht wird, haben Najera et al. schlugen ein Reagens in Form eines Polymers vor und die endgültige β-Alaninamid-Verunreinigung wurde auf dem Polymerträger immobilisiert. Diese Methode schränkt jedoch die Verwendung zur Herstellung kleiner Mengen geschützter Aminosäuren ein.

Andere reaktive Substanzen, die üblicherweise mit Carbodiimid-Kupplungsverbindungen verwendet werden, wie Pentafluorphenyl (Pfp) oder Benzotriazol (Bt), sind zwar relativ teuer (Pfp) oder explosiv (Bt) (Tabelle 1, Nr. 8, 9), aber die Ausbeuten sind hoch , und einige Labore haben sogar Fmoc-Triazin-Derivate (Tabelle 1, Nr. 10) als Möglichkeit zur Synthese von Fmoc-Aminosäuren untersucht. Für die Methode zur Einführung von Fmoc unter Verwendung einer reinen wässrigen Lösung wurde Fmoc-Phenyldimethylsulfoniummethylsulfat (Fmoc-ODsp) verwendet, die Bildung des Dipeptids wurde jedoch nicht untersucht (Tabelle 1, Nr. 11).

Um eine der größten Herausforderungen bei der Synthese von Peptidbausteinen zu bewältigen, nämlich die unerwünschte Bildung von Dipeptiden und Tripeptiden beim Aminosäureschutz, wurde der Ansatz einer Vielzahl von Fmoc-Abgangsgruppen intensiv untersucht. Obwohl eine kleine Anzahl von Reagenzien gute Ergebnisse erzielt hat, hat fast keines davon das Potenzial, in der industriellen Produktion eingesetzt zu werden. In diesem Zusammenhang wurde basierend auf der Struktur des häufig verwendeten Carbodiimid-Additivoxims das Fmoc-Abgangsgruppenderivat Fmoc-Amox vorgeschlagen. Fmoc-Amox wurde zum Schutz von H-Gly-OH, das sehr anfällig für Nebenreaktionen ist, mit hoher Ausbeute (93 %) eingesetzt, und es entsteht überhaupt kein Nebenprodukt in Form von Fmoc-Dipeptid, was dazu führen kann durch HPLC und NMR-Analyse bestätigt werden. Darüber hinaus könnten Amox-Derivate in Zukunft zur Einführung anderer Schutzgruppen wie pNZ, Alloc und Boc verwendet werden.

Die Ashish-Gruppe glaubt, dass Oxyma ein besserer Zusatzstoff als Carbodiimid ist. Oxyma verfügt über eine starke Reaktivität und wird zunehmend in der industriellen Produktion von Peptiden eingesetzt. Die Gruppe untersuchte auch andere weniger reaktive Oximderivate zur Einführung der Fmoc-Gruppe aus dem ersten Screen (Tabelle 1, Nr. 12–16), einschließlich 2-Hydroxypyridin-N-oxid (HOPO), abgeleitet von Oxyma (Tabelle 1, Nr. 12). ergab aufgrund seiner hohen Reaktivität einen höheren Gehalt an Dipeptid, gefolgt von HOPO (Tabelle 1, Nr. 16). Cyanopyridiniumoxim ist ebenfalls ein gutes Additiv (Tabelle 1, Nr. 15), aber es ist teuer und schwer aus der Reaktion zu entfernen. Die Dipeptidbildung im zweiten Screen war im Allgemeinen geringer (Tabelle 1, Nr. 17–20), daher wurde das Cyanoamid-Derivat (Amox) (Tabelle 1, Nr. 20) als Alternative zu HOSu zur Einführung von Fmoc ausgewählt. Fmoc-Amox ist erschwinglich und kann nach der Reaktion leicht entfernt werden. Im Gegensatz zu MBT hat Amox eine Löslichkeit von 0,9 M in Wasser, was sicherstellt, dass es die endgültige Fmoc-Aminosäure nicht verunreinigt (Tabelle 1, Nr. 4). .

Im Hinblick auf die Fmoc-Dipeptidbildung erwies sich H-Gly-OH aufgrund seiner geringen sterischen Hinderung, die ein hohes Oligomerisierungsverhältnis begünstigt, als das beste Reagens zur Bewertung der Leistung von Fmoc-Amox. Unter Verwendung von 1 Gramm und 40 Gramm zweier paralleler Experimente zur Herstellung von Fmoc-Gly-OH liegen die Ergebnisse nahe beieinander, und der Reaktionsprozess wird wie folgt beschrieben: Die Acetonlösung von Fmoc-Amox wird langsam zu dem gerührten H-Gly-OH und Natrium gegeben Eine wässrige Carbonatlösung wurde durch kontinuierliche Trennung von Natriumcarbonat diskontinuierlich zugegeben, um den pH-Wert der Reaktionsmischung bei 9–10 zu halten. Die Reaktion wurde durch TLC sowie die pH-Stabilität überwacht (ein Abfall des pH-Werts als Zeichen der Reaktion). Nach Abschluss der Reaktion (4 Stunden) wurde das Lösungsmittel entfernt und die verbleibende wässrige Schicht mit DCM gewaschen, gefolgt von der Zugabe von 1 N HCl (bis pH <2), was zu einem cremefarbenen Niederschlag führte, der dann filtriert wurde und mit Ethylacetat und n-Hexan (93 %) behandelt. Nach der Umkristallisation war die durch HPLC nachgewiesene Reinheit von Fmoc-Gly-OH sehr gut. Da durch Festphasentechnologie hergestelltes Fmoc-Gly-Gly-OH zusammen mit Fmoc-Gly-OH eluiert wird, deutet dies darauf hin, dass die gebildete Dipeptidverunreinigung schwer zu entfernen ist, wie in Abbildung 3 dargestellt, und wird im Chromatogramm nicht beobachtet Spuren von Dipeptiden (Abbildung 3). Darüber hinaus zeigte das 1H-NMR keine Verunreinigung von Amox (Abb. 4), was deutlich zeigt, dass Amox einen großen Vorteil bei der Synthese von Fmoc-Aminosäuren hat.

Abbildung 3 (A) HPLC-Chromatogramme von Fmoc-Gly-OH und Fmoc-Gly-Gly-OH, die gemeinsam eluieren
(B) HPLC-Chromatogramm von Fmoc-Gly-OH

Abbildung 4 Vergleich des 1H- und 13C-NMR von Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Amox und Amox

Motiviert durch diese Ergebnisse wurden Fmoc-Phe-OH und Fmoc-Val-OH (jeweils 10 g Miniversuche) mit der oben beschriebenen Methode hergestellt (Abbildungen 5 und 6). Die Reinheit des Endprodukts wurde durch HPLC und NMR bestätigt und zeigte keine Spurenbildung von Dipeptid. Auch die Bedeutung des Lösungsmittels bei der Aufarbeitung wurde untersucht. Das resultierende Produkt wurde in DCM gelöst und mit destilliertem Wasser extrahiert. Die DCM-Aufarbeitung trug dazu bei, Spuren von Amox zu entfernen, was zu einem reinen Produkt führte, wie durch NMR bestätigt (Abb. 7).

Abbildung 5 (I) A. HPLC-Chromatogramm von Fmoc-Phe-OH und Fmoc-Phe-Phe-OH, die gemeinsam eluieren
B. HPLC-Chromatogramm von Fmoc-Phe-OH
(II) 1H- und 13C-NMR-Vergleich von Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Amox und Amox

Abbildung 6 (I) A. HPLC-Chromatogramm von Fmoc-Val-OH und Fmoc-Val-Val-OH, die gemeinsam eluieren
B. HPLC-Chromatogramm von Fmoc-Val-OH
(II) 1H- und 13C-NMR-Vergleich von Fmoc-Val-OH, Fmoc-Amox und Amox

Abbildung 7 Vergleich der Nachbehandlungen von Fmoc-Phe-OH, extrahiert mit Ethylacetat und DCM

Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass Fmoc-Amox große Vorteile bei der Synthese von Fmoc-Aminosäuren hat, die am anfälligsten für Nebenreaktionen sind.

Beispiel für die Synthese von Fmoc-Aminosäuren:

1. Glycin (131,34 mmol) und Natriumcarbonat (106 mmol) zu gereinigtem Wasser hinzufügen und Fmoc-Amox (119,4 mmol) Acetonlösung tropfenweise hinzufügen, um sicherzustellen, dass der pH-Wert der Reaktionslösung immer bei 9–10 gehalten wird. Nachdem durch TLC festgestellt wurde, dass die Fmoc-Amox-Reaktion abgeschlossen war, wurde die Reaktionslösung konzentriert, um Aceton zu entfernen, und dann mit Dichlormethan extrahiert, um Verunreinigungen zu entfernen. Die wässrige Phase wurde mit 1 N HCl angesäuert und es fiel eine große Menge weißer Feststoffe aus. Nach der Filtration wurde der Filterkuchen dreimal mit gereinigtem Wasser gewaschen. Der gesammelte Feststoff wurde mit Ethylacetat/n-Hexan umkristallisiert, um hochreines Fmoc-Glycin zu erhalten.

2. Geben Sie Phenylalanin oder Valin (33 mmol) und Natriumcarbonat (75 mmol) zu gereinigtem Wasser und geben Sie tropfenweise Fmoc-Amox (30 mmol) Acetonlösung hinzu, um sicherzustellen, dass der pH-Wert der Reaktionslösung immer bei 9–10 gehalten wird. Nachdem durch TLC festgestellt wurde, dass die Fmoc-Amox-Reaktion abgeschlossen war, wurde die Reaktionslösung konzentriert, um Aceton zu entfernen, und dann mit Dichlormethan extrahiert, um Verunreinigungen zu entfernen. Die wässrige Phase wurde mit 1 N HCl angesäuert und es fiel eine große Menge weißer Feststoffe aus. Nach der Filtration wurde der Filterkuchen dreimal mit gereinigtem Wasser gewaschen. Der gesammelte Feststoff wurde mit Ethylacetat/n-Hexan umkristallisiert, um hochreines Fmoc-Phenylalanin oder Fmoc-Valin zu erhalten.

Seit seiner Gründung im Jahr 2003 konzentriert sich Suzhou Haofan Biological Co., Ltd. auf die Forschung und Entwicklung sowie die Produktion von Produkten im Bereich Kondensationsmittel und Schutzmittel, die durch charakteristische Amidbindungen gebildet werden. Es verfügt über ein komplettes Sortiment und hohe Qualität. Kunden können gerne kaufen. Weitere Produkte finden Sie auf der offiziellen Website von Haofan Biological.