Eine kurze Einführung in die Racemisierung von Aminosäuren in der Polypeptidsynthese

Peptidentwicklung:

Seit Fischers Gruppe im Jahr 1901 die erste Dipeptidmolekülsynthese abschloss, hat die Peptidsynthese eine mehr als 100-jährige Geschichte. Mit der steigenden Nachfrage nach Peptiden in den Bereichen Arzneimittelentwicklung und Materialchemie hat die Forschung zu Peptidsynthesestrategien viele Fortschritte gemacht.

Racemisierung in der Peptidbindungssynthese war schon immer ein großes Problem und einer der Hotspots in der Peptidchemie. Die Bildung von Peptidbindungen erfordert dieAktivierung von Carbonsäuren, und die aktivierten Carbonsäure-Zwischenprodukte sowie der anschließende Kondensationsprozess können zur Racemisierung führen.

Racemisierungsmechanismus:

Eine eingehende Untersuchung ergab, dass es zwei Mechanismen für diese Racemisierung gibt. Der erste Mechanismus ist die direkte Racemisierung – das Wasserstoffproton wird direkt aus dem α-Kohlenstoff extrahiert (Weg A); Der zweite Mechanismus erfolgt über den Prozess des Oxazolrings – das α-Wasserstoffproton des Oxazolrings wird eingefangen (Pfad B). Der Racemisierungsmechanismus ist in der folgenden Abbildung dargestellt:

Abbildung 1: Racemisierungsmechanismus (A) direkte Racemisierung; (B) Racemisierung über den Oxazolring

Faktoren, die die Racemisierung beeinflussen:

Es gibt drei Hauptfaktoren, die die Racemisierung von Peptidbindungen beeinflussen:

(1) Der Faktor Alkali;

(2) additive Faktoren;

(3) Faktoren des Kondensationsmittels.

Erstens: Alkalischer Faktor

Carpin o et al. entdeckte in den 1990er Jahren, dass die Basizität und die sterische Hinderung organischer Basen einen großen Einfluss auf die Racemisierung haben. Die am häufigsten verwendeten organischen Basen in Peptidkondensationsreaktionen sind N, N-Diisopropyl Diethylethylamin (DIEA), N- Methylmorpholin (NMM) und 2,4,6-Collidin(TMP, Collidin). Unter ihnen ist N,N-Diisopropylethylamin basischer (pKa10,1), N-Methylmorpholin (pKa 7,38) und 2,4,6-Collidin (pKa 7,43) ist aufgrund der größeren sterischen Hinderung von 2,4,6-Collidin (TMP, Collidine) schwächer, bei vielen Peptidbindungsbildungen führt die durch 2,4,6-Collidin (TMP) erzeugte Racemisierung zu weniger. Darüber hinaus weist das häufig verwendete Triethylamin aufgrund seiner geringeren sterischen Hinderung und stärkeren Alkalität eine schnellere Racemisierungsrate auf als N, N-Diisopropylethylamin und N-Methylmorpholin.

Die folgende Abbildung zeigt die Racemisierungsrate von Aminosäure-N-Carbonsäureanhydrid (NCA)-Derivaten:

Die Ergebnisse von N-Carbonsäureanhydrid-Derivaten von Aminosäuren, die mit verschiedenen organischen Basen racemisiert und dann mit Benzylamin kondensiert wurden, sind in der folgenden Abbildung dargestellt:

Dieses Ergebnis zeigt, dass 2,4,6-Collidin (TMP, Collidine) das am wenigsten racemische Produkt produzierte.

In einem anderen Bericht haben Carpino et al. fanden ähnliche Ergebnisse bei der Kopplung von Polypeptidfragmenten. 2,4,6-Collidin (TMP, Collidine) erzeugte die am wenigsten racemischen Produkte. Bei dieser Reaktion führt eine Kondensation des Dipeptids Z-Phe-Val-OH mit Alaninmethylesterhydrochlorid (H-Ala-OMe.HCl) immer zu der geringsten Racemisierung von TMP, unabhängig vom verwendeten Kondensationsmittel.

Die Racemisierung der Z-Phe-Val-Ala-OMe-Peptidfragmentsynthese (2+1) ist in der folgenden Abbildung dargestellt:

Zweitens die additiven Faktoren

Das Hinzufügen von Additiven ist eine gängige Methode in der Peptidsynthese, die die Ausbeute steigern und Nebenreaktionen der Racemisierung reduzieren kann – insbesondere bei der Verwendung von Carbodiimid-artigen Kondensationsmitteln wie DIC ist das Hinzufügen von Additiven besonders wichtig. Derzeit sind die am häufigsten verwendeten Zusatzstoffe hauptsächlich einige Benzotriazolverbindungen (HOXt), darunter hauptsächlich HOBt, HOAt und 6-Cl-HOBt. Diese Benzotriazolverbindungen sind stark sauer (pKa HOBt: 4,60, pKa HOAt: 3,28, pKa 6-Cl-HOBt: 3,35) und können mit Carbonsäuren reaktive Zwischenprodukte bilden. Wir wissen, dass Carbodiimid-Kondensationsmittel auch aktive Zwischenprodukte mit Carbonsäuren bilden können – O-Acylisoharnstoffverbindungen. Im Vergleich zu O-Acylisouridverbindungen ist das aus Benzotriazol und Carbonsäure gebildete aktive Zwischenprodukt jedoch stabiler, wodurch die Umlagerung von O-Acylisouridverbindungen in N-Acylisouridverbindungen und damit der Verlust der Reaktivität. Unter den oben genannten drei Additiven weist HOBt die geringste Aktivität und normalerweise die meisten racemischen Nebenreaktionen auf. HOAt hat die beste Aktivität und die geringsten Nebenreaktionen der Racemisierung. Der Beteiligungseffekt der ortho-Position des Stickstoffatoms in 7-Position am Pyridinring von HOAt ist der Schlüsselfaktor für seine hohe Aktivität.

In den letzten Jahren wurden von Albericios Gruppe einige neue oximhaltige Additive entwickelt und erfolgreich für die Synthese von Peptidbindungen eingesetzt. Die beiden wichtigsten Zusatzstoffe sind Ethyl-2-oximcyanacetat (OxymaPure) und 1,3-Dimethylvilinat (Oxyma-B). Bei Verwendung in Kombination mit dem Carbodiimid-Kondensationsmittel DIC ist die Kondensationsausbeute von Ethyl-2-oximcyanoacetat und 1,3-Dimethylvilinsäure vergleichbar mit der von HOAt, aber die Nebenreaktion der Racemisierung ist geringer. Bei der anspruchsvolleren [2+1]-Kondensationsreaktion von Peptidfragmenten zeigten Ethyl-2-oximcyanoacetat und 1,3-Dimethylvilinsäure ebenfalls bessere Razemisierungshemmwirkungen als HOBt. In weiteren Experimenten zur Validierung der Racemisierung haben Albericio et al. nutzte die Festphasensynthese zur Herstellung mehrerer Tripeptidverbindungen. Diese Tripeptide enthalten einige Aminosäuren, die besonders anfällig für Racemisierung sind – Serin (Ser), Cystein (Cys) und Histidin (His). Es wurde festgestellt, dass 1,3-Dimethylsilylsäure (Oxyma-B) die beste Wirkung auf die Hemmung der Racemisierung hatte, sogar besser als HOAt und Ethyl-2-oximcyanoacetat (OxymaPure).

Die Synthese (Festphasensynthese) von Z-Phg-Pro-NH2 ist in der folgenden Abbildung dargestellt:

Die Kondensation (Lösungsphasensynthese) des Dipeptids Z-Phe-Val-OH und H-Pro-NH2 ist in der folgenden Abbildung dargestellt:

Die Festphasensynthese des Tripeptids H-Gly-AA-Phe-NH2 (AA = Ser, Cys, Cys (Acm) oder His) ist in der folgenden Abbildung dargestellt:

Drittens der Faktor des Kondensationsmittels

Kondensationsreagenzien haben verschiedene Strukturen und Typen und umfassen hauptsächlich die folgenden Kategorien: Carbodiimide, Ammoniumsalze, Phosphorsalze, Pyridiniumsalze, Chinoline, Phosphate usw. HOXt, OxymaPure und Oxyma-B können mit einigen Ammoniumsalzen oder Phosphorsalzen kombiniert werden zu eigenständigen Kondensationsmitteln werden. Die meisten der oben genannten Kondensationsmittel führen jedoch zu einem hohen Grad an Racemisierung. Um das Auftreten einer Racemisierung zu verhindern, müssen daher der Reaktion Racemisierungsinhibitoren wie HOBt, HOAt und Oxyma zugesetzt werden, um eine Racemisierung durch den gebildeten aktivierten Ester zu verhindern. Drehung.

Kürzlich berichtete das Team von Gregory L. Beutner von der Bristol-Myers Squibb Company über ein sehr effizientes Säureamid-Kondensationssystem. Acylimidazoliumsalze gelten seit langem als sehr effiziente Acyltransferreagenzien und werden bei der Synthese von Amiden verwendet. Auch die Aktivität von Imidazoliumsalzen ist höher als die von Acylimidazolen. Acylimidazoliumsalze erfordern im Allgemeinen Acylimidazol und starke Alkylierungsreagenzien wie Meerweinsalz, Methyliodid usw., Rapoport et al. berichteten, dass CDI-analoges Stickstoff-Methylimidazoliumsalz für die anspruchsvolle saure Aminkondensation verwendet wird, allerdings ist die Trennung von Reagenzien von hochreaktiven Alkylierungsreagenzien eine Herausforderung für sich. Der von Gregory et al. ist, dass es nicht notwendig ist, hochaktive Acylimidazoliumsalze zu isolieren, aber eine wirksame Strategie zur effektiven Kombination von TCFH und NMI, um es in situ zu erzeugen und es in anspruchsvollen Säure-Amid-Kondensationsreaktionen zu verwenden, sehr gute Ergebnisse erzielt hat. Der Effekt und das Produkt können eine gute Chiralität erhalten. Der Reaktionsmechanismus ist wie folgt:

Das Reaktionssystem kann 99,9 % der Chiralität der Peptidsynthese aufrechterhalten, und die Wirkung der Hemmung der Racemisierung und die Ausbeute sind sehr gut, wie in der folgenden Abbildung dargestellt:

Im Jahr 2020 wurde die ACS-Katalyse von Wataru Muramatsu et al. aus Japan berichteten über die Silan-vermittelte Säure-Amin-Kondensationsreaktion, die auch das Problem der Racemisierung gut löste. Die Reaktionsbedingungen dieses Reaktionssystems sind sehr mild und die Reaktion ist in der folgenden Abbildung dargestellt:

Die PG-Schutzgruppe in der Abbildung oben kann Acetyl, Benzoyl und andere Gruppen sein. Für andere Kondensationsmittel dieses Aminosäuretyps ist es im Allgemeinen schwierig, die Racemisierung gut zu kontrollieren.

Verweise:

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